前言

眼病的流行率正在全世界范围内上升，对其中大多数人来说是没有有效的治疗方法。损害视力的疾病，如黄斑变性或青光眼，是老年人致残和丧失独立生活方式的主要原因。另一方面，近视也在急剧上升，在部分地区，高达90%的青少年受到影响。瑞士巴塞尔的研究人员正在使用各种尖端技术——包括单细胞基因组学——来了解其中一些疾病背后的分子机制，目的是开发有效的治疗方法。

用户案例分享

巴塞尔的分子与临床眼科学研究所（IOB）成立于2018年，旨在帮助研究人员和临床医生提高对视力及其疾病的理解，并开发治疗视力丧失的新疗法。作为其发展的一部分，IOB建立了一个先进的单细胞基因组学设施，为希望在研究中使用这些技术的研究所其他小组提供指导、支持和建议。该部门的目标之一是开发新的单细胞方法，以提高数据质量，增加样本通量和降低成本。平台负责人Simone Picelli解释说:“多年来，我一直在研究单细胞RNA测序，试图找出可以自动化和小型化的新想法或新方案，以降低成本并提高效率。我们最近开发了一种新的工作流程——FLASH-seq^1,2，我们还使用Tecan的Fluent自动化工作站实现了自动化。”

 

“我们发现，自动化我们的单细胞RNA文库制备已经大大提高了我们的通量、数据质量和可重复性……

 

在过去的十年里，单细胞RNA测序已经改变了基因组学，基于微孔板法——比如Smart-seq2³——通常被用作油包水乳法的替代方法。这些方法具有更优的灵敏度和提供全长转录本信息的能力，但它们通常需要大量的动手时间，导致通量较低和单个样本的成本提高。Simone继续说道：“我们开发了FLASH-seq来解决这些问题，在一个工作日内生成测序文库，同时提供更优的数据质量。我们已经创建了一个自动版本的FLASH-seq工作流程，其中通量取决于反应数和孵化时间，人工干预仅限于主混合物的制备，几乎所有的分液和纯化步骤都由仪器执行。我们发现，自动化我们的单细胞RNA文库制备已经大大提高了我们的通量、数据质量和可重复性，同时还降低了试剂成本并节省了时间。”

用户使用心得

IOB在开发自动化工作流程时求助于Tecan，以确保液体处理系统能够满足其特定需求。“我已经使用Tecan设备很多年了，”Simone补充道。“我开始使用Freedom EVO®，我非常喜欢它直观的软件和良好的台面空间。它也非常坚固，即使我当时完全没有经验。当我搬到巴塞尔时，我切换到更新的Fluent自动化工作站，虽然我很乐意继续使用Freedom EVO，但我也看到迁移到Fluent平台的明显优势。”

FLASH-seq工作流程的几乎每一步都是自动化的-包括单细胞分离，cDNA制备，纯化，质量控制和定量，以及NGS文库制备-以简化板的处理。“我们使用384孔板来开展该方案，许多步骤都是使用Fluent实现自动化的。有几个阶段需要将液体转移或添加到每个孔中，这可以通过MCA机械臂上的384通道加样头一步完成，因此整个微孔板仅需5秒钟。该机械臂还可以移液300nL的水溶液，这是DNA或引物理想的转移体积。我们还需要为不同孔添加index接头，这在Fluent中很容易做到。台面上有足够的空间来存放微孔板和一次性吸头盒，十分方便，允许我们并行处理多个微孔板。我们还有一个整合的振荡模块，用于需要使用磁珠的步骤，因为这些步骤需要磁珠充分混匀以防止沉降。”

 

 

自动化单细胞RNA测序工作流程使研究人员可以更大限度地减少动手时间，提高可重复性和管理成本，小型化可以进一步节省这些成本。Simone总结道：“我已经与Tecan软件合作多年，并且可以轻松地开发越来越复杂的脚本，因为我知道该系统利于复制且强大。这使我们能够开发出非常高效的自动化FLASH-seq工作流程，与其他已发表的方法相比，可以更轻松地检测到更多基因。”

 

更多详情

 

想要了解Tecan自动化NGS文库制备解决方案的更多信息，请访问 lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation

有关IOB单细胞基因组学平台的更多信息，请访问www.iob.ch/research/molecular-research-center/single-cell-platform-s-picelli

 

参考文献

 

1. Hahaut V. et al. Fast and highly sensitive full-length single-cell RNA sequencing using FLASH-seq. Nat Biotechnol, 2022, 40, 1447-1451. doi:10.1038/s41587-022- 01312-3

2. Picelli S. and Hahaut V. FLASH.seq protocol V.4. protocols.io, 2023. doi:10.17504/protocols.io.kxygxzkrwv8j/v4

3. Picelli S. et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods, 2013, 10, 1096-1098. doi:10.1038/nmeth.2639