源自血管周祖细胞的间充质干细胞（MSC）属于多能成体干细胞，具有高度的自我更新能力。在体外培养条件下，它可以被定向诱导分化成脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、成骨细胞。
通常，向终末分化的细胞会失去自我更新的能力，这个过程会阻碍细胞增殖。认识细胞在分化和增殖间转换的分子机制，对人干细胞研究有举足轻重的意义。

在Spark 10M酶标仪上，结合PromoCell公司开发的细胞学试剂，可实时分析人干细胞的分化。整个实验方便快速，可定量、重复且高灵敏地检测细胞活性，增殖以及凋亡。最终结果表明，在体外启动间充质干细胞分化后，细胞分裂并没有立即停止，反而在某些特定条件下，细胞增殖被短暂地诱导升高了。

Spark 10M拥有非常适合细胞学研究的特点和功能，如细胞明场成像、气体控制、温度及独特的湿度控制等，满足几乎所有生命科学研究应用。

 

本实验在96孔微孔板中进行，间充质干细胞过夜贴壁后，我们将细胞培养液分组更换成以下四种定向诱导分化培养液：

• adipogenic (PromoCell C-28016)

• osteogenic (PromoCell C-28013)

• chondrogenic (PromoCell C-28012)

• neurogenic (PromoCell C-28015)

 

细胞板置于Spark 10M湿度控制盒中（ 37°C ，5% CO2），在接下来的60个小时中监测MSC的分化情况。我们分别使用PromoCell的WST-8、EdU试剂和Caspase-3三种试剂，检测细胞活性、增殖和凋亡情况。
干细胞的自我更新与分化间的平衡是受到精确调控的，且其终末分化被认为是会中止细胞增殖的。然而，在体外培养时，干细胞对分化刺激的反应有多快，我们知之甚少。本实验的目标就是监测MSC在体外分化早期的增殖特性。

 
一．WST-8试剂对细胞没有毒性，活细胞可以将其转化成黄色的水溶性甲臜，适合长时间实时监测细胞活性。下图表明，在分化的初始阶段，活性的上升是由于活细胞数量或细胞活力的增加。

 

图1. 实时测量WST-8转化获得干细胞分化过程中的活细胞数

 

二．进一步对MSC的DNA合成进行检测，目标为胸苷类似物EdU的摄入量。结果表明，相比控制组，诱导软骨和成骨细胞分化条件下的MSC呈现出显著的EdU摄入量增加。

 

图2. 通过EdU摄入量监测干细胞分化引起的细胞增殖情况

然而，诱导脂肪和神经细胞生成的分化条件下，细胞DNA合成速度无明显变化。因此，在第一组活性实验中，软骨和成骨细胞生成组的活性变化可以认定为细胞增殖的结果。

 

三．为了排除潜在死细胞对结果评价的影响，我们还进行了最后一组实验，在MSC细胞刚被转移到4组诱导分化培养液后，就对细胞凋亡酶活进行了检测。

图3.干细胞分化过程中caspase-3酶的活性监测

虽然在大部分诱导刺激条件下，细胞并没有caspase-3酶活的改变，但在软骨细胞生成组却呈现出强健但短暂的凋亡酶活性。尽管如此，在软骨细胞生成组并没有伴随进一步的细胞死亡发生。因此，caspase诱导的部分细胞死亡似乎并没有影响MSC分化细胞的活性。

 

综上所述，在间充质干细胞（MSC）被诱导分化的前60个小时里，分化MSC细胞呈现了显著的细胞数量或活力的提升（相比对照组）。在软骨细胞和成骨细胞生成组，DNA合成速度的提升表明细胞增殖被诱导增加。相反，脂肪细胞和神经细胞分化诱导组的细胞增殖却和对照组表现相当，因此，细胞分化培养液引起的代谢加速可能是导致细胞活力增加的主要原因。

另外，在软骨细胞诱导组分化早期，我们发现细胞有强劲但短暂的凋亡酶活性，但此凋亡出现似乎对软骨细胞分化生成有积极作用，并没有引起后续细胞死亡。值得注意的是，在体外间充质干细胞启动分化后，细胞分裂并没有立即停止，反而在某些特定条件下细胞增殖却因分化诱导升高了。

最后，上述实验也表明，在Spark 10M多功能酶标仪多种细胞学实验功能特征的帮助下，可轻松进行细胞计数，铺板以及随后长达数日的干细胞分化培养，真正实现多参数实时自动化检测分析。

 

 

 

本实验获得PromoCell的大力支持。Dr. Hagen Wieland (PromoCell) 推荐使用的细胞，Dr. Jürgen Becker (PromoCell) 推荐可行的实验内容和方案。在此表示诚挚的谢意。