加拿大太平洋生物学工作站的分子生物学实验室采用DNA分析方法识别和跟踪来自不同产卵地的鲑鱼。自动化NGS技术为该实验室引入了一种可替代编码金属线标系统、基于亲子关系标记(PBT)的高性价比方法。

太平洋生物学工作站位于加拿大大不列颠哥伦比亚省纳奈莫，属于加拿大渔业及海洋部运营的九大科研基地网络一员，是一家主管太平洋鲑鱼捕捞的政府机构。作为太平洋海岸最古老的渔业研究中心，这里坐落着分子基因学实验室(MGL)，负责测定太平洋鲑鱼鱼群结构、预估混合资源鲑鱼渔业的资源构成。

大不列颠哥伦比亚省的Chinook和Coho鲑鱼资源量随着产卵地的产量而增加，其中的部分幼鱼在放生时便采用金属线标(CWT)进行了标记。如果渔场捕捞到含有CWT的个体，则可以测其放生的年龄和孵卵地。但是采用CWT标记成本昂贵，且只有杀死标记对象才可检测到标记，而且由于并非所有的鱼均已标记，无法识别所有鲑鱼的产地。为此，可采用一种更具性价比的替代方法，即基于亲子关系的标记(PBT)方法——这一过程包括产卵地亲鱼资源的基因分型过程。通过建立各个产卵地亲鱼资源基因型数据库，可以对后代进行非侵入性采样，从而根据亲子关系确定产卵地和亲鱼年份。完成标记后，可有效标记所有幼年鲑鱼均并追踪到具体产卵地。

“我可以预见，NGS将会成为未来很多应用首选的方法”。

早在上世纪90年代，MGL就已开始采用DNA分析方法。研究科学家Terry Beacham称：“太平洋鲑鱼捕捞受《美加太平洋鲑鱼公约》管辖。为了遵守该公约条款，必须测定鱼群中的Chinook和Coho鲑鱼源产地。过去一直采用CWT完成这一工作，但现在可改用PBT技术。PBT可比CWT更精准地预测渔业资源构成，有助于在商业化和休闲渔业中测定各原产卵地的构成比例。如果对是否保护特定的渔业资源疑问，则在知晓渔业资源的时间和产地的情况下，可以判定特定水域的适当封网时机。”

Terry继续补充说：“此前，渔业资源构成主要通过微卫星分析判定——这仍是我们实验室使用最频繁的技术——尤其是需要在24小时内获得结果的应用。在渔季，我们需要在几周内通过微卫星分析数千条太平洋鲑鱼，预测渔业资源构成，从而帮助渔场决定开网或封网。最近，我们采用了自动化的NGS操作流程，可以高性价比分析数百个单核苷酸多态性(SNP)。在我们一开始考虑采用SNP进行鱼群基因识别时，我们需要进行多个0SNP分析才能获得等效于微卫星分析的结果——依据当时的平台成本和通量，这基本上不可行。随着NGS操作方案出现，我们购买了Ion Proton™系统，可以高性价比同时分析数百个SNP，进而开发出了可以监控Chinook和Coho鲑鱼（大不列颠哥伦比亚省产卵地孵化的主要鲑鱼物种）的方法。”

为了充分利用Ion Proton系统的通量能力，同时为了给实验室提供更大的灵活性，MGL购买了两台Freedom EVO® 100工作站。“通常，我们会收到100份固定在Whatman滤纸上的脂鳍孔样。随后采用Chelex方法从孔样中手动提取DNA，或采用BioSprint仪器自动提取孔样DNA，以便直接进行Applied Biosystems AgriSeq™文库制备。首先，在采用第二个工作站的MultiChannelArm™ 96将引物试剂盒加入到96孔板中之前，先扩增DNA并采用配备Air LiHa™的Freedom EVO平台将DNA数据归一化为40 ng/μl浓度。目前，我们根据物种，调查了300到350个扩增子，但希望将这一范围扩展到500个扩增子以上。降解之后，采用一组384条码接头连接扩增产物，随后将富集的文库转移到Ion Chef™上。这种处理可以获得可在Ion Proton系统上直接测序的芯片，进而从中测定鲑鱼的基因型。”

“我们之所以选择Tecan，是因为它是一个知名品牌，有着良好的声誉和产品质量。此外，他们还有一项额外的优势，即该公司针对与Thermo Fisher Scientific合作开发的Ion AgriSeq文库制备方法，提供了经验证、灵活的海洋生物学测序实验方案。我们的一位技术人员曾参加过Freedom EVOware®培训课程，通过这项课程获得的知识使她可以针对不同的分组用户编写许多脚本——这颇具优势。我们目前已运行这一系统约两年，而且针对我们的应用开发了工作流程并优化了脚本。如今我们每周可运行四个芯片——相当于1500条鱼——这个通量可以说是非常高了。虽然NGS在渔业管理领域还是非常新的技术，但我预计，它在将来定能成为许多应用首选的方法。”Terry总结道。

加拿大渔业和海洋部负责监控太平洋鲑鱼群

在脂鳍处打孔取样

样品在滤纸上封固并送到实验室

 

上述所有Tecan产品均仅可用于研究用途，不可用于临床诊断。

更多有关Tecan基因组学解决方案的信息，请见www.tecan.com/genomics
更多有关加拿大渔业和海洋部太平洋生物学工作站的信息，请见www.pac.dfo-mpo.gc.ca/science/facilities-installations/pbs-sbp/ index-eng.html