对细胞膜完整性和细胞活性的长时间动态监测，例如长达72小时的实时观测，可以帮助了解细胞原发性坏死和继发性坏死的发生时间。更进一步，通过对caspase-3/7活性的检测，我们还可以在细胞毒性事件中辨别凋亡和坏死这两种不同的机制。为此，我们采用了Promega的三种检测试剂。





其中，RealTime-Glo™和CellTox™ Green试剂在细胞铺板时加入，用于长时间实时检测。Caspase­Glo® 3/7试剂通过Spark的加样器加入，裂解细胞后实行终点法检测。

通常情况下，为了实现活细胞动态观测，需要每隔一段时间把细胞板从培养箱中取出进行检测，再放回培养箱中继续培养，有时反反复复几十次。另外，很多检测细胞活力和毒性的试剂都是终点法，为了实现细胞的动态检测，需要准备多块微孔板在不同的时间点进行测定，很不方便。



在Tecan Spark10M多功能微孔板检测仪上，使用Promega细胞健康检测试剂，这一切都将变得非常简单。RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay及CellTox™ Green Cytotoxicity Assay无需裂解细胞，分别使用发光和荧光作为检测信号，可实现长达72小时的动力学检测。

Tecan Spark 可配备自动化无人值守实验所需的所有功能——温度及气体控制、湿度控制、自动开盖抓手和自动进样器等。仪器内部可精确控制5% CO₂和37℃；湿度盒可有效防止液体挥发；开盖抓手可在读取信号或自动加样前自动揭去板盖，并在检测完成后盖上，整个流程无需人工介入。


细胞毒性事件发生后，我们还需要在合适的时间窗口进行caspase-3/7活性检测，以明确细胞是凋亡还是坏死。

caspase-3/7的检测窗口一般很短暂，检测时机选择很关键，在不同窗口检测会得出凋亡或坏死的不同结论，并直接影响药物作用模式的解释。

有试验表明，caspase-3/7的活性与药物介导的细胞毒性有相关性，即药物处理后，细胞毒性荧光信号上升到对照组1.4倍时，caspase-3/7的活性是可以检测的。据此，Spark 10M可以以此数值为阈值条件，控制自动进样器完成对整板样本的Caspase-Glo3/7试剂加样，裂解细胞并孵育半小时，自动完成数据读取。



总体表明，在Tecan Spark10M 多功能酶标仪上，配套promega细胞健康试剂盒，可以全自动化、无人值守地在同一次试验中同时完成细胞活力、毒性和凋亡三组数据，既有动力学方法，也有终点检测。同时，Spark还可以帮助优化细胞凋亡检测的时机，有助于分析药物细胞毒性的机制和成因。

 

更多信息请参考

http://lifesciences.tecan.com/products/reader_and_washer/microplate_readers/spark10m

 

参考材料

1. Anwalkawaymonitoringcytotoxicityviabilityandapoptosis  (Tecan 399451 V1.0
   05--2016)

2. RealTime--Glo™ MT Cell Viability Assay Kit Protocol (TM431, 9/14)

3. CellTox™ Green Cytotoxicity Assay Kit Protocol (TM375, 5/15)

4. Caspase-Glo®3/7 Assay Kit Protocol  (TB323, 3/15)